–MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO

Meios de cultivo é um a mistura de nutrientes, sais minerais e água que propiciam o crescimento invitro de bactérias. A constituição de um meio de cultivo é bastante variada, pois os micro-organismos apresentam uma ampla diversidade metabólica. Portanto os meios de cultivo possuem

componentes nutricionais variados promovendo o crescimento de micro-organismos mais exigentes e menos exigentes.

Até 1880 os micro-organismos eram cultivados em meios

líquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras) separando-as de espécies contaminadas.

Os meios de cultivo são utilizados para o isolamento e

identificação de micro-organismos, teste para controle de

esterilização ambiental, análise de alimentos e de água, etc. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceto as riquétsias e clamídias por serem parasitas intracelulares

obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo celular).

Basicamente, um meio de cultivo deve conter além de

extrato de carne para o fornecimento de proteínas proteínas,

carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sódio.

A preparação dos meios de cultivo pode ser realizada no

laboratório de microbiologia de duas formas:

(1)a partir de seus ingredientes básicos.

(2)a partir dos desidratados disponíveis comercialmente, ou

podem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placas de Petri.

Didaticamente, os meios de cultivo cultivo podem ser

classificados quanto à consistência, quanto à procedência, quanto à composição, e quanto à função.

a) Quanto à consistência: os meios podem ser líquido, semi-sólido e sólido.

Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão

dissolvidos em aquosa. São os caldos (“broth). É utilizado para ativação das culturas, repiques de micro-organismos, provas bioquímicas dentre outros.

Meio semi-sólido: Esse meio possui na sua composição além dos nutrientes, ágar (polissacarídeoextraído de algas

marinhas) na concentração de 0,075% a 0,5%. É usado para

Meio sólido: É um meio que possui na sua composição

nutrientes e uma concentração de 1,0 a 2,0% de Agar e distribuído em placas,tubos em vertical ou inclinados.

b)Quanto a procedência: os meios podem ser:naturais,

artificiais sintéticos, ou artificiais complexos.

- Meios naturais: São aqueles de origem vegetal (batata,pão)

Animal( gema de ovo, carne, cérebro etc.)

- Meios artificiais sintéticos: São aqueles de composição quimica definida. Ex: Glicose

- Meios artificiais complexos: São aqueles que se desconhece a exata composição química. Ex:Extrato de carne.

c) Quanto à função: O meio de cultivo pode ser enriquecedor, seletivo, diferenciador e de manutenção.

Meio enriquecedor ou enriquecido: É aquele que tem sua

capacidade nutricional, permitindo o crescimento de micro-organismos exigentes .

Ex: BHI, Ágar sangue, Agarchocolate .

Meio seletivo: É aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos micro-organismos, sem impedir o crescimento de outros.

Ex: Ágar SS,(Salmonella , Shigella)

Meio diferenciador ou indicador: É empregado para detectar

colônias bacterianas com propriedades distintas. As

bactérias acidogênicas são conhecidas pela ação da cor do

indicador ácido-base adicionado ao meio.

As bactérias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas zonas claras produzidas nos meios contendo suspensões de amido.

Bactérias hemolíticas são visualizadas pelas alterações produzidas no ágar sangue.

Os produtores de gás sulfídrico formam uma zona escura de sulfito de ferro no meio contendo excesso de ferro. Ex: Ágar EMB, Ágar sangue.

- Meio de manutenção: É um meio utilizado para estocagem de baixo teor nutritivo para evitar a rápida morte celular, devido a eliminação de substâncias tóxicas resultantes do metabolismo dos micro-organismos. Ex: Ágar nutriente.

- Meio para crescimento anaeróbico: Como os anaeróbios não sobrevivem na presença de oxigênio são utilizados meios especiais denominados meios redutores, esses meios contém ingredientes como o tioglicolato de sódio, que se combinam quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam do meio de cultura.

Outros métodos: Jarra de anaerobiose, estufas de dióxido de carbono.

*Preparação:

Um fator que influencia na preparação do meio de cultivo é a

temperatura. Ao preparar um meio de cultivo não podemos manter à temperatura ambiente uma solução não estéril por

mais de uma hora devido à possibilidade de evaporação da

água decrescimento microbiano.

Alguns componentes são utilizados pelos microrganismos e os demais, pelo efeito d o crescimento microbiano.Alguns

componentes são utilizados pelos micro-organismos e os

demais, pelo efeito da evaporação,se concentram. Após preparados os meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilização adequada.

*Técnica:

Preparação de meio líquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart-

Infusion).

Componentes do meio:

Infusão de coração ................... 250g

Infusão de cérebro ................... 200g

Peptona ............................... 10g

Dextrose................................ 2g

Cloreto de Sódio ....................... 5g

Fosfato de Sódio ..................... .2,5g

Água destilada ....................... 100ml

Execução:

a)Adicionar 100ml de água destilada aos ingredientes

previamente pesados;

b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen

ou forno de microondas;

c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml

por tubo. Colocar tampão de algodão em cada tubo;

d)Autoclavar (121ºC por 15 a 20 minutos).

Preparação de meio sólido: Meio Ágar nutriente (Ágar Base) ou Ágar Gelose.

Componentes do meio:

Extrato de Carne ....................... 3g

Peptona ................................ 5g

Ágar .................................. 15g

Água destilada ...................... 1000ml

*Conservação dos meios de cultivo

Após preparados, os meios devem ficar à temperatura

ambiente até o esfriamento total. Quando a quantidade de meio preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve ser armazenado em geladeira dentro de sacos plásticos para evitar desidratação. Quando a quantidade de meio for grande e não de uso imediato, deve ser distribuído em frascos com rolha, selados com tampas de alumínio e logo após autoclavados.

A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode

ser conservada à temperatura ambiente durante anos e outros que contenham substâncias termolábeis em sua composição são guardados em geladeiras.

Para usar frascos de meio líquido, abrimos o selo de

alumínio, retiramos a rolha de borracha com cuidados

assépticos e, em ambiente estéril, transferimos o meio para

tubos estéreis (através de pipetas).

Para usar frascos de meio sólido, fundimos o ágar

imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno de microondas a temperatura de 100oC. Após a fusão do ágar abrimos o selo de alumínio, retiramos a rolha de borracha e transferimos o meio para tubos (através de pipetas estéreis) ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura ambiente.